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Ca++ Mg++-ATP 酶活性测定(微量法)说明书
点击次数:332 发布时间:2019-02-26

货号:YJ1174                                           规格:100管/48样

Ca++ Mg++-ATP 酶活性测定说明书

微量法

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

Ca++ Mg++-ATP 酶广泛分布于植物、动物、微生物和细胞中,可催化ATP水解生成ADP和无机磷。

测定原理:

根据Ca++ Mg++ -ATP 酶分解ATP生成ADP及无机磷,通过测定无机磷的量来确定ATP酶活性高低。

需自备的仪器及用品:

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制:

提取液:液体 100mL×1 瓶,4℃保存。

试剂一:液体 10mL×1 瓶,4℃保存。

试剂二:粉剂×1 瓶,-20℃保存;临用前加入6mL蒸馏水充分混匀待用;用不完的试剂 4℃保存一周;

试剂三:液体 2mL×1 瓶,4℃保存。

试剂四:粉剂×1 瓶,4℃保存。用时加入3mL蒸馏水, 4℃保存。

试剂五:粉剂×1 瓶, 4℃保存。用时加入25mL蒸馏水,溶解后 4℃保存一周。

试剂六:粉剂×1 瓶, 4℃保存。用时加入25mL蒸馏水,溶解后 4℃保存一周。

试剂七:液体25mL×1 瓶,室温保存。

试剂八:10mmol/L 标准磷贮备液 10mL×1 瓶,4℃保存。

0.5μmol/mL标准磷应用液配制:将试剂八20倍稀释,即取0.1mL试剂八加1.9mL蒸馏水充分混匀。

定磷剂的配制:按 H2O: 试剂五:试剂六:试剂七=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷剂应为浅黄色。若无色则试剂失效,若是蓝色则为磷污染,定磷剂现用现配。

注意:配试剂建议用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器,也可以用一次性塑料器皿,避免磷污染。

样品酶液的制备:

1、细菌、细胞或组织样品的制备:

细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

2、血清(浆)样品:直接检测。

操作步骤:

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 660nm,蒸馏水调零。

2、酶促反应(在 EP 管中加入下列试剂)

 

对照管

测定管

试剂一(μL)

65

45

试剂二(μL)

60

60

试剂三(μL)

 

20

样本 (μL)

 

100

混匀,37℃(哺乳动物)或 25℃(其他物种)准确水浴 10min

试剂四(μL)

25

25

样本 (μL)

100

 

混匀,8000g,25℃离心 10min,取上清液

3、定磷(在 EP 管或 96 孔板中加入下列试剂)

 

空白管

标准管

对照管

测定管

0.5μmol/ml标准磷应用液(μL)

 

20

 

 

上清液(μL)

 

 

20

20

蒸馏水(μL)

20

 

 

 

定磷试剂(μL)

200

200

200

200

混匀,室温放置30min,在660nm处,记录各管吸光值。

注意事项:

1、由于每一个样都必须做对照,本试剂盒100管只能测48份 Ca++ Mg++-ATP酶。

2、此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格无磷。避免磷污染是

检测成败的关键。

3、空白管和标准管只要做一管。

Ca++ Mg++-ATPase 活力的计算:

1、血清(浆)Ca++ Mg++-ATPase 活力的计算:

定义:每小时每毫升血清(浆)中Ca++ Mg++-ATP酶分解ATP产1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。

Ca++ Mg++-ATP 酶活力(μmol/h/mL)= [C 标准管×V 总]×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷V 样÷T=7.5×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)

2、组织、细菌或细胞中Ca++ Mg++-ATPase 活力的计算:

(1)按蛋白浓度计算:

定义:每小时每毫克组织蛋白中Ca++ Mg++-ATP酶分解ATP产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。

Ca++ Mg++-ATP酶活力(μmol/h/mg prot)= [C标准管×V总]×(A测定管-A对照管)÷(A 标准管-A空白管)÷(V样×Cpr)÷T =7.5×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:

定义:每小时每克组织中Ca++ Mg++-ATP酶分解ATP产生1μmol无机磷的量为一个酶活力

单位。

Ca++ Mg++-ATP酶活力(μmol/h/g 鲜重)=[C标准管×V总]×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷(W× V样÷V样总)÷T=7.5×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

定义:每小时每1万个细菌或细胞中Ca++ Mg++-ATP酶分解ATP产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。

Ca++ Mg++-ATP酶活力(μmol/h /104cell)= [C标准管×V总]×(A测定管-A对照管)÷(A 标准管-A空白管)÷(500×V样÷V样总)÷T=0.015×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)

C 标准管:标准管浓度,0.5μmol/mL;V 总:酶促反应总体积,0.25mL;V 样:加入样本体

积,0.1mL ;V 样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,1/6 小时;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本鲜重,g;500:细菌或细胞总数,500 万。

 

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