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线粒体复合体Ⅳ试剂盒(微量法)说明书
点击次数:114 发布时间:2019-02-26

货号:YJ1172                                      规格:100管/96样

线粒体复合体Ⅳ试剂盒说明书

微量法

正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

线粒体复合体Ⅳ又称细胞色素C氧化酶,也是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分,负责催化还原型细胞色素C的氧化,并终把电子传递给氧,生成水。

测定原理:

还原型细胞色素C在550nm有特征光吸收,线粒体复合体Ⅳ催化还原型细胞色素C生成氧化型细胞色素C,因此550nm光吸收下降速率能够反映线粒体复合体Ⅳ酶活性。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制:

试剂一:液体 100mL×1 瓶,-20℃保存;

试剂二:液体 20mL×1 瓶,-20℃保存;

试剂三:液体 1.5mL×1 瓶,-20℃保存;

试剂四:液体 20mL×1 瓶,4℃保存;

试剂五:粉剂×1 支,-20℃保存;

试剂六:粉剂×1 支,-20℃保存;

样本的前处理:

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

1、准确称取0.1g组织或收集500万细胞,加入1mL试剂一和10uL试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、将匀浆 600g,4℃离心 5min。

3、弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11100g,4℃离心 10min。

4、上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅳ(此步可选做)。

5、步骤④中的沉淀即为线粒体,加入200uL试剂二和2uL试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10秒,重复30次),用于复合体Ⅳ酶活性测定。

测定步骤:

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至550nm,蒸馏水调零。

2、样本测定

(1)工作液的配制:临用前将试剂五和试剂六依次转移到试剂四中混合溶解,置于37℃(哺

乳动物)或 25℃(其它物种)孵育5min;用不完的试剂 4℃可保存一周;

(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本和200μL工作液,混匀,立即记录550nm

处初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2,计算 ΔA=A1-A2。

注意点: 若 ΔA 大于0.2,需将样本用试剂二稀释适当倍数(计算公式中乘以相应稀释倍数),

使 A1-A2 小于 0.2,可提高检测灵敏度。

复合体Ⅳ活力单位的计算:

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下:

(1) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化降解1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅳ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T

=1099×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

(2) 按样本鲜重计算

单位的定义:每g组织每分钟催化降解1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅳ活力 (nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d )×109]÷(W×V样÷V样总)÷T=222×ΔA÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟催化降解1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅳ活力(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.444×ΔA

V 反总:反应体系总体积,2.1×10 -4 L;ε:细胞色素 C 摩尔消光系数,1.91×104 L/ mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,1 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。

b.使用 96 孔板测定的计算公式如下:

(1) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化降解1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅳ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T

=2198×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

(2) 按样本鲜重计算

单位的定义:每g组织每分钟催化降解1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅳ活力 (nmol/min/g 鲜重 )=[ΔA×V反总÷(ε×d )×109]÷(W×V样 ÷V样总)÷T=444×ΔA÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟催化降解1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅳ活力(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.888×ΔA

V 反总:反应体系总体积,2.1×10 -4 L;ε:细胞色素 C 摩尔消光系数,1.91×104 L/mol/cm;d:96 孔板光径,0.5cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,0.202mL;T:反应时间,1 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。

 

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