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神经HRP示踪显色液(TMB法)说明书
点击次数:302 发布时间:2019-02-13

 HRP示踪色液(TMB法)说明书

 

上个世70 年代,Kristensopn Olsson 道了HRP可神末梢经轴浆逆行至神元胞体,经组织化学方法可示出神元的廓,从而HRP  追踪神示踪技,即HRP 法。3,3',5,5'-四甲基苯胺(TMB)是非常越的试验显,能

溶解于多有机溶和双蒸水中,为稳定的无色溶液,不适量氧化或双氧水不冲液混   匀后,不氧化物作用生清晰的物,极易察,在辣根氧化物的催化下 , TMB 色沉淀,沉淀溶于水和乙醇,色后呈色,可在察。

HRP 示踪色液(TMB )麻醉、注入HRP后,游离或合型HRP 不氧化生成合物,该络合物氧化供TMB ,呈色,在下清晰可该检测DAB  法灵敏。该显色液用于科研域,宜用于断或其他用途。

 

 

 

 

 

 

50T

试剂(A): TMB assay buffer

2×500ml

RT 避 光

试剂(B): TMB  色液

30ml

-20℃ 避 光

试剂(C): TMB  强剂

2×1ml

RT

试剂(D): TMB Wash buffer(20×)

100ml

RT

操作步骤(供参考)

 (一)、准工作

1物麻醉:多用(3.5%)戊巴比麻醉,大鼠的麻醉0.25-0.35ml/100g

2HRP:有力注射法、泳法以及周的注射涂抹等法。

3、确定物存活期。

4物灌注:麻醉后,左心室升主脉插管行心内灌注固定。先用生理水或 PBS 快速灌注。随后用 4%的多聚甲固定液灌注,先快后慢,时间控制在 30-40min。后用 10% 蔗糖磷酸冲液(pH7.4)

5材:组织置于 20%的蔗糖磷酸盐缓冲液中,切片厚度 40μm,存于蔗糖磷酸盐缓用。

(二)、色反

1、配制TMB孵育液:适量的TMB assay buffer TMB色液,按 TMB assay bufferTMB色液=39:1 的比例混合,即TMB孵育液,即配即用,宜保存。

2、配制TMB色工作液:适量的TMB孵育液和TMB强剂,按TMB孵育液:TMB 强剂=200080001 的比例混合(具体比例根据具体时间摸索确定),即TMB工作液,即配即用,宜保存。

3、配制 1×TMB Wash buffer适量的TMB Wash buffer(20×),按TMB Wash buffer: 蒸=1:19 的比例混合,即1×TMB Wash buffer。室温保存6月有效。

4、切片用蒸水清洗 3 次,2min

5、切片入10ml TMB孵育液(提前 20℃温育),避光孵育20min,其断晃

6、切片入10ml TMB 色工作液(提前 20℃温育),避光孵育 20min,其断晃7、漂洗:10ml左右的1×TMB Wash buffer 漂洗切片2-3 次,5min

8片,玻片用明胶包被,室温空气干燥。

9、脱水、透明步骤按如下操作:

10s

②70%乙醇  10s

③95%乙醇  10s

④100%乙醇 2 次,10s

二甲苯2次,25min

  1. 中性胶封片,色反

 

 注意事

1、如果出高的反背景或沉淀,表明TMB底物反应过烈。

2、所用器皿必须洁净,避免含有氧化,否生非特异性反

3TMB色液避免反复冻融,以免色效率下降。

4TMB强剂注意密保存,否则显色效率下降。

有效期: 12 个月内有效。   

 

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